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林镜中博士撰文论述新型冠状病毒检测试剂之灵敏度
发布日期:2020-02-27  浏览次数:2699
赛格诺生物林镜中博士在中国体外诊断网(CAIVD)发表文章,从引物探针设计的角度论述新型冠状病毒实时荧光RT-PCR检测灵敏度的问题。以下为全文。


新型冠状病毒荧光PCR引物探针设计之我见

 CAIVD 中国体外诊断网 CAIVD 2020年2月20日


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CAIVD

 

 

新型冠状病毒疫情爆发以后,早期诊断成为控制疫情的关键,而荧光PCR技术成为首选的初筛检测手段。目前核酸检测率只有30-40%,使得检测试剂盒的灵敏度备受关注。本期推荐林镜中博士从引物探针设计的角度对试剂盒灵敏度的分析,以飨读者。

 

一、前言

 


新型冠状病毒疫情爆发以后,早期诊断成为控制疫情的关键,而荧光PCR技术成为首选的初筛检测手段。到目前为止已经有数家企业获得了新型冠状病毒荧光PCR检测试剂的临床注册批文,还有近百家企业开发了类似的产品。近期有诸多声音反映现有的新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒灵敏度较低,目前检出率只有30-40%,多次出现漏检的情况。业界对此进行了广泛的讨论,一个共识是造成检出率低,假阴性率高有很多原因,包括试剂盒的灵敏度、试剂盒原材料的质量、核酸提取的效率、仪器设备的质量、操作误差等,但是对试剂盒的灵敏度低的原因没有系统的分析。笔者认为,引物探针设计是决定试剂灵敏度的关键,设计上存在的问题是内在缺陷,很难通过优化试剂盒组分和调整实验条件来得到显著改善。

早期诊断的灵敏度事关新型冠状病毒疫情防控的成败,同时今后将有一大批企业申报该产品的注册批文,最终推向检测市场,对人民健康产生深远的影响。疫情爆发后,世界卫生组织(WHO)发表了多个国家设计的新型冠状病毒荧光PCR引物探针序列。笔者常年从事分子检测试剂的研究开发,特别是荧光PCR技术。新型冠状病毒疫情爆发后,我们也进行了相关产品的研发,我们发现WHO发布的来自不同国家的引物探针设计,有些存在比较明显的缺陷。本文以美国CDC设计的N基因引物探针为例,论述Taqman荧光PCR引物和探针设计的基本原则,并提出一些建议,供同行们参考,避免走弯路,浪费资源,也算是为抗击疫情尽一份力量。

任何技术都有优缺点,站在不同的角度,侧重点不一样,或者使用的参数或算法或软件不一样,结论也可能各有所异。
理论分析毕竟与临床样本检验的结果不可同日而语。产品的灵敏度最终都得经过临床试验,达到注册检验要求为标准。文中观点难免偏颇,欢迎批评指正。

 

二、Taqman探针法荧光PCR的基本原理

 

实时荧光PCR是一种实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术。Taqman探针法是实时荧光PCR中应用最广泛的技术。它的基本原理是在反应中加入一对特异的引物及一条经荧光标记的Taqman探针,探针的5’端用报告荧光基团标记,3’端用淬灭荧光基团标记。在探针完整时,由于荧光共振能量转移(FRET)的作用,报告基团的荧光被淬灭基团吸收发出不同于仪器收集波长的荧光,不能检测到扩增信号,因此探针必须依赖Taq酶的5’-3’的外切活性,在引物结合到模板后随着合成双链的进程,将已经与模板结合成双链的探针切割,使报告荧光基团脱离淬灭基团的屏蔽而发出仪器应检测的荧光信号。常用的报告基团包括HEX、FAM、ROX、JOE、VIC等,淬灭基团包括TAMRA、BHQ等。


 

三、Taqman探针法荧光PCR引物探针的设计

 

 一些最基本的原则可以参考美国ABI(赛默飞)的PrimerExpress 3.0指南(表1)。

 

表1:Taqman荧光PCR探针和引物设计指南(PrimerExpress 3.0, ABI)

TaqMan Probe(探针)

Primer(引物)

ProbePrimer的距离越近越好,PCR产物大小50-150 bp

G/C % 30-80 %

避免重复序列的出现,尤其避免4个以上连续的G

Tm: 68-70 (Quantification assay) 65-67 (Allelic Discrimination assay)

Tm: 58-60

Probe :
13-25 bases (TaqMan MGB probe) 13-30 bases (TaqMan probe)

Primer :
20 bases (Optimal)

避免连续6A的序列出现

3’端前5个序列里不能超过2C+G

5’端第一个列不能为G (如果选择FAM-dye,在5’端的第二个序列也不能为G)

选择CG多的strand当作probe

避免3’端的前4个序列里含有3个或以上的G(GGG-MGB-3’or GGAG-MGB-3’)

避免probe的中间区域含有2个或以上的CC di-nucleotides


根据我们的经验,最重要的参数包括引物探针的位置、Tm值、发夹结构、二聚体。以下以WHO发表的美国CDC的N基因引物探针(表2)为例加以详细论述。

 

表2: 美国CDC设计的引物探针序列

2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-time rRT-PCR Panel Primers and Probes

Name

Description

Oligonucleotide Sequence (5’>3’)

Label

Working Conc.

2019-nCoV_N1-F

2019-nCoV_N1 Forward Primer

5’-GAC CCC AAA ATC AGC GAA AT-3’

None

20 μM

2019-nCoV_N1-R

2019-nCoV_N1 Reverse Primer

5’-TCT GGT TAC TGC CAG TTG AAT CTG-3’

None

20 μM

2019-nCoV_N1-P

2019-nCoV_N1 Probe

5’-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3’

FAM, BHQ-1

5 μM

2019-nCoV_N2-F

2019-nCoV_N2 Forward Primer

5’-TTA CAA ACA TTG GCC GCA AA-3’

None

20 μM

2019-nCoV_N2-R

2019-nCoV_N2 Reverse Primer

5’-GCG CGA CAT TCC GAA GAA-3’

None

20 μM

2019-nCoV_N2-P

2019-nCoV_N2 Probe

5’-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3’

FAM, BHQ-1

5 μM

2019-nCoV_N3-F

2019-nCoV_N3 Forward Primer

5’-GGG AGC CTT GAA TAC ACC AAA A-3’

None

20 μM

2019-nCoV_N3-R

2019-nCoV_N3 Reverse Primer

5’-TGT AGC ACG ATT GCA GCA TTG-3’

None

20 μM

2019-nCoV_N3-P

2019-nCoV_N3 Probe

5’-FAM-AYC ACA TTG GCA CCC GCA ATC CTG-BHQ1-3’

FAM, BHQ-1

5 μM

RP-F

RNAse P Forward Primer

5’-AGA TTT GGA CCT GCG AGC G-3’

None

20 μM

RP-R

RNAse P Reverse Primer

5’-GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT-3’

None

20 μM

RP-P

RNAse P Probe

5’-FAM – TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG – BHQ-1-3’

FAM, BHQ-1

5 μM

01

引物探针的位置

引物探针的设计原则中,最重要的是要避免假阴性(漏检),同时保证特异性(避免假阳性),所以要选择组内(需要检出的序列)保守(即尽量避开突变或采用简并序列)、组间(对照序列)特异的区域。此外,为了获得最佳的扩增效果,还应尽量满足表1中的基本要求。

用SARS和蝙蝠CoV的N基因序列作为对照,对新型冠状病毒的N基因序列排序,从图1、2、3中可见,在美国CDC的设计中,除了第二套的上游引物不特异外,其余探针和引物的位置都是选择了组内保守组间特异的区域。第二套的探针和下游引物都是在特异的区域,所以也不会产生非特异的扩增。


图1:
美国CDC 2019-nCoV 第一套引物探针位置

图2:美国CDC 2019-nCoV 第二套引物探针位置